【引言】
VEGF受体2（VEGFR2）信号转导在实体瘤血管生成和转移中的重要作用促使人们开发出具有最小旁观者效应的抑制剂。近年来，Adnectin-C在肿瘤治疗中引起了广泛的关注。
【成果介绍】
为了克服Adnectin存在的问题，本文设计了一种新型的Adnectin C，将其融合到含有Pro/Ala/Ser（PAS）重复残基的可生物降解多肽中。用标准方法比较大肠杆菌表达的重组融合蛋白和未融合蛋白的生物活性、理化性质和药代动力学特性。使用Linseis STA PT1600热分析仪器进行DSC和TG实验。动态光散射（DLS）分析表明，磷酸化Adnectin C的粒径增加了约2倍，净电荷略有变化。此外，PAS序列的融合提高了其抗热诱导聚集形式生长的稳定性。酶联免疫吸附试验（ELISA）和表面等离子体共振实验分别证实了酶联蛋白C的高受体结合和改进的结合动力学参数。药代动力学研究显示，单次静脉注射给雌性BALB/C小鼠后，Adnectin C-PAS#1（200）的最终半衰期显著增加了4.57倍。结果表明，磷酸化可以作为开发Adnectin衍生药物的一种更好的给药策略，提高患者的依从性。
【图文导读】
图1：纯化重组蛋白的蛋白印迹分析和15%SDS-PAGE：纯化Adnectin C的电泳迁移率。Lane 1：蛋白质标记，Lane 2，3：纯化蛋白的洗脱1和2（纯化蛋白分别为0.2mg/ml）；（a右）纯化连接蛋白C-PAS#1（200）的电泳迁移率。一道：蛋白质标记；第二道至第四道：纯化蛋白质的洗脱2-4（分别为0.1、0.3和1mg/ml纯化蛋白）。Western-blot分析鉴定出：（b 左）Adnectin C；（b右）Adnectin C-PAS 1（200）的特定键。箭头显示产品预期尺寸的范围。完整长度的印迹和凝胶如补充图S2-S4所示。
图2：流体动力学半径和质谱表征。（a）Adnectin C主峰在96.35nm处；（b）Adnectin C-PAS#1（200），主峰在192.3nm。MALDITOF/TOF波谱显示，Adnectin c的分子量为11374.4160Da；Adnectin c-PAS#1（200）为28076.5703Da。完整的MALDI/TOF质谱在补充图S5中给出。
图3：（a） 7 cm IPG条带上磷酸化Adnectin C和天然蛋白的IEF。两种蛋白质在pI=6.5-6.8时具有相似的净电荷。1道为标记，2道为Adnectin C-PAS 1（200），3道为Adnectin C。Zeta电位分布曲线为：（b）Adnectin C；（c）Adnectin C-PAS 1（200）。测量显示，Adnectin C-PAS#1（200）（-5.28mV）和天然蛋白（−6.15mV）之间的zeta电位差异可以忽略不计。
图4：不同温度和冻融条件下蛋白质聚集性的热分析和评价：（a）DSC热图；（b）双态去折叠酶解结合蛋白C和天然蛋白的TG曲线。样品在pH 6.8的磷酸盐缓冲液中制备，并以2°C/min的升温速率在惰性气氛中进行分析。在两个温度图中，观察到相对于天然蛋白的Pasylized Adnectin C和天然蛋白质的可忽略的变化；（c）在规定的温度和孵育时间下，PASylated Adnectin C和天然蛋白质聚集。加热后A340nm的大幅度增加表明热稳定性降低。数据表示为平均值±标准差（三个重复）。重组蛋白（<0.01）的聚集性（<0.01）和重组蛋白（<0.01）。观察到：（d）天然蛋白（96.35nm-733.7nm）和（e）磷酸化蛋白（192.3-266.6nm）的峰位移。观察到低聚集形式的磷酸化。
图5：酶联免疫吸附试验（ELISA）检测Adnectin C和Adnectin C-PAS#1（200）与rhVEGFR2的结合。数据表示为平均值±标准差（三个重复）。PASylated Adnectin在低于天然蛋白的浓度下达到饱和。
图6：.Adnectin C和Adnectin C-PAS#1（200）对培养的HUVECs的毒性评估（a），重组蛋白对VEGF诱导的HUVECs增殖的抑制作用（b），以及Adnectin C-PAS 1（200）（C）作用机制的示意图。Te数据表示为平均值±SD（三个重复）。星号显示样本的存活率与VEGF组相比有显著性差异（****p<0.0001）。
图7：Adnectin C和Adnectin C-PAS#1（200）抑制VEGF诱导的HUVECs迁移：（a）重组蛋白抑制VEGF诱导的HUVECs通过跨孔膜的迁移。Te数据表示为平均值±SD（三个重复）；#表示与VEGF组（阳性对照）有显著差异（p<0.0001）。星号表示与未处理（阴性）对照组的显著差异（**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）；（b）染色膜的代表性照片表明，与对照组相比，这两种蛋白质显著抑制了HUVEC的迁移（见补充图S6中的原始照片）。
图8：BALB/C小鼠5mg/kg给药后Adnectin C和Adnectin C-PAS#1（200）的药代动力学研究。Te图显示，磷酸化蛋白在循环中的停留时间比天然蛋白长。
【结论】
工程化的Adnectin C除了在体外维持其药理作用外，在稳定性、药代动力学参数和生物活性方面具有促进磷酸化的作用。然而，需要临床前的数据来证实磷酸化Adnectin-C优于Adnectin-C。磷酸化可能是延长Adnectin半衰期的一种合适的方法，其特征可与peg酸化相媲美。基于这些结果，磷酸化Adnectin C可能是一种很有前途的临床治疗药物
